Kit de dosage immunoenzymatique compétitif
Analyse quantitative de l'apramycine
1. Contexte
L'apramycine est un antibiotique aminosides, qui est largement appliquée dans le traitement des maladies animales. Pour qu'il a de la neurotoxicité et le rein la toxicité, de ses résidus dans les aliments dérivés des animaux est nuisible à l'homme ; il est strictement contrôlé en usage dans l'UE, US et de la Chine. À présent, ELISA est l'approche commune de la supervision et de contrôle des drogues aux aminosides
Ce kit est un nouveau produit résiduel pour les médicaments détection basée sur la technologie ELISA, qui coûte seulement 50min dans chaque opération et peut considérablement réduire les erreurs de fonctionnement et l'intensité de travail.
2. Principe de test
Ce kit est basée sur la concurrence indirecte ELISA de la technologie. Le puits Microtiter sont enduites avec couplage antigène. L'apramycine de résidus dans l'échantillon est en concurrence avec l'antigène enduits sur la plaque d'microtiter pour l'anticorps. Après l'ajout d'enzyme conjugué, substrat TMB est utilisé pour afficher la couleur. L'absorbance de l'échantillon est négativement liée à l'apramycine résident dans elle, après comparaison avec la courbe standard, multiplié par la dilution des résidus de multiples, l'apramycine quantité dans l'échantillon peut être calculée.
3. Les applications
Ce kit peut être utilisé en analyse quantitative et qualitative de l'apramycine de résidus dans les tissus des animaux (muscle et le foie) et de miel. de l'oeuf ,
4. Les réactions croisées
L'apramycine ......................…100 %
La streptomycine...............…........…....<0,1 %
À la kanamycine................<0,1 %
La néomycine...............................….....<0,1 %
De gentamycine.......................…<0,1 %
La tobramycine................…<0,1 %
5. Matériel requis
5.1 Équipement :
----Plaque Microtiter spectrophotomètre (450nm/630nm)
----Évaporateur rotatif ou système de séchage des gaz d'azote
----L'homogénéisateur
----Shaker
----Mélangeur Vortex
----Centrifuger
----Balance analytique (inductance: 0.01g)
----Pipette graduée, : 10ml
----L'ampoule de pipette en caoutchouc
----Fiole jaugée : 100ml, 1L
----Tube à essai de verre : 10ml
----Tube à centrifuger en polystyrène : 2ml, 50ml
----Micropipettes : 20 μl-200μl, 100μl-1000μl
250μl-multipipette
5.2 Réactifs
----L'acide trichloroacétique (AR)
----Chlorure de sodium (NaCl, AR)
----Le chlorure de potassium (KCl, AR)
----Phosphate monopotassique (KH2PO4, AR)
----Phosphate disodique dodecahydate
(Na2HPO4.12H2O, AR)
----L'eau désionisée
6. Composants du kit
Avec la plaque 96 puits Microtiter enduites avec l'antigène
L'apramycine solutions standard(6×1 ml/bouteille)
0ppb, 0.9PPB 0.3PPB 0.1PPB,,, , 8.1Ppb 2.7ppb
Solution étalon de fortification : 1ml, 1 ppm
(7 ml de solution d'anticorps)............…capuchon vert
Conjugué enzymatique (7ml) ............…bouchon rouge
Une solution de substrat (7ml)............capuchon blanc
Solution de substrat B (7 ml)............…bouchon rouge
Solution d'arrêt (7 ml)...............…bouchon jaune
20×la solution de lavage concentrée (40ml)
............…..........….Bouchon transparent
2×concentrés solution d'extraction (50ml)
.....................…..Bouchon bleu
7. Préparation des réactifs
Solution 1 : 2 % de l'acide trichloroacétique
Poids 20g Acide trichloroacétique, ajouter de l'eau désionisée diluer jusqu'à 1000ml,mélanger complètement.
Solution 2 : 1,5 % Acide trichloroacétique-0.16M PBS
Dissoudre 32,0, 0,8 NaCl KH2PO4, 21,4 g de Na2HPO4.12H2O, 0,8 g KCl, 7.5G Acide trichloroacétique avec l'eau et diluer à 500 ml.
Solution 3 : solution d'extraction
Diluer la solution d'extraction 2×concentré avec l'eau désionisée dans le volume ratio de 1:1, qui sera utilisé pour l'extraction de l'échantillon, cette solution peut être stockée à 4 ºC pendant 1 mois.
Solution 4 : solution de lavage
Diluer la solution de lavage 20×concentré avec l'eau désionisée dans le volume ratio de 1:19, qui sera utilisée pour laver les plaques. Cette solution peut être stockée à 4 ºC pendant 1 mois.
8. Préparatifs de l'échantillon
8.1 Avis et précautions avant intervention :
(A) Veuillez utiliser one-off de conseils dans le processus d'expérience, et de modifier les conseils d'absorber différents réactif.
(B) Vérifiez que tous les instruments expérimentaux sont propres, sinon il aura une incidence sur l'essai résultat.
(C) Conserver dans l'échantillon de tissu animal inutilisées de geler.
(D) Veuillez lean lorsque le tube à centrifuger en prenant le surnageant couche après centrifugation.
(E) l'échantillon préparé peuvent être stockées pour 12h à 4oC.
8.2 Le muscle
----Retirer le gras, et homogénéiser l'échantillon;
----Peser 2,0±0,05 g de l'homogénat dans un tube à centrifuger en polystyrène 50ml, ajouter 10ml de solution 1, et agiter complètement pour 5min ;
----Centrifuger à température ambiante pendant 5 min, au moins 3000g;
----Prendre le surnageant 100μl à tube à centrifuger en polystyrène de 2 ml , diluer avec 800 μl de solution d'extraction (solution 3),vertex 3 min, mélangez complètement ;
----Emporter 50 μl de la solution préparée pour l'assay.
8,3 Foie
---- Homogénéiser l'échantillon d'abord, mélanger complètement.
----Peser 2,0±0,05 g de l'homogénat échantillon dans un tube à centrifuger en polystyrène 50ml, ajouter 10ml de solution 2, et agiter pendant 5 min; complètement
----Centrifuger à température ambiante pendant 5 min, au moins 3000g;
----Prendre le surnageant 100μl, diluer avec de 800 μl de solution d'extraction (solution 3), vertex 30s,mélanger complètement (pH = 6-7);
----Emporter 50 μl de la solution préparée pour l'assay.
8.4 L'oeuf(oeuf frais et cuit oeuf)
-----Homogénéiser l'échantillon d'abord, mélanger complètement.
----Peser 1,0±0,05 g de l'homogénat échantillon dans un tube à centrifuger en polystyrène 10ml, ajouter 4 ml de l'eau désionisée et 0.3g NaCl, et agiter complètement pour 5min ;
----Centrifuger à température ambiante pendant 5 min, au moins 3000g;
----Prendre le surnageant 100μl à tube à centrifuger en polystyrène de 2 ml , diluer avec 500 μl de solution d'extraction (solution 3), mélanger complètement ;
----Emporter 50 μl de la solution préparée pour l'assay.
8.5 Le miel
-----Pondération de 1,0±0,05 g de échantillons de miel en tube 10ml polystyrène,ajouter 4 ml d'eau désionisée , vertex 2min jusqu'à l'échantillon de miel se dissoudre complètement .
------Prendre 500l dissoudre l'échantillon dans le tube de verre , ajouter 500l extraction Solution (solution 3),mélanger complètement .
------Prendre 50l mix solution pour le dosage .
9. Processus de dosage
9.1 Avis avant d'essai :
9.1.1 Vérifiez que tous les réactifs et les micropuits sont tous à température ambiante (20-25 ºC).
9.1.2 Retour tous les réactifs de repos à 2-8ºC immédiatement après avoir utilisé.
9.1.3 Laver les micropuits correctement est une étape importante dans le processus de dosage; c'est le facteur essentiel à la reproductibilité de l'ELISA L'analyse.
9.1.4 d'éviter la lumière et de couvrir les micropuits au cours de l'incubation.
9.2 Étapes :
9.2.1 Prendre tous les réactifs à la température ambiante (20-25 ºC) pendant plus de 30 min, agiter doucement avant utilisation.
9.2.2 Obtenir les micropuits nécessaires et le reste de retour dans le sac à fermeture par glissière à 2-8ºC immédiatement.
9.2.3 Nombre : nombre chaque micropuits position et toutes les normes et les échantillons doivent être exécutées en double. Enregistrer les normes et des échantillons des postes.
9.2.4 Ajouter /sample standard : ajouter 50ul de solution étalon ou de l'échantillon préparé à puits correspondant. Ajouter 50 μl conjugué enzymatique, 50 μl de solution d'anticorps. Mélanger doucement par agitation de la plaque manuellement et incuber pendant 40min à 25 oC avec le couvercle.
9.2.5 Laver : déposer le couvercle doucement et pure le liquide des puits et rincez les micropuits avec 250 μl de solution de lavage dilué (solution 4) à l'intervalle de 10s pour 4 à 5 fois. Absorber l'eau résiduelle avec du papier absorbant (le reste de l'air bulle peut être éliminé avec pointe inutilisé).
9.2.6 La Coloration : ajouter 50 μl de solution A et 50 μl de solution B à chaque puits. Mélanger doucement par agitation de la plaque manuellement et incuber pendant 15 min à 25 oC avec couvercle
9.2.7 Mesure : ajouter 50UL de la solution d'arrêt à chaque puits. Mélanger doucement par agitation de la plaque manuellement et mesurer l'absorbance à 450Nm (il est recommandé de mesurer avec le double longueur d'onde de 450/630nm. Lire le résultat dans un délai de 5 min après l'addition de solution d'arrêt).
10. Les résultats
10.1 Pourcentage l'absorbance
Les valeurs moyennes de l'absorbance valeurs obtenues pour les normes et les échantillons sont divisés par la valeur d'absorbance de la première standard (standard zéro ) et multiplié par 100 %. Le standard zéro est donc égale à 100 % et l'absorbance valeurs sont cités dans les pourcentages.
B
L'absorbance (%) = -- ×100 %
B0
B --l'absorbance (standard ou un échantillon)
B0 --l'absorbance standard zéro
10.2 Courbe standard
----Pour dessiner une courbe standard : prendre la valeur d'absorbance de normes comme l'axe des y, semi logarithmique de la concentration de la solution de l'apramycine normes (ppb) comme l'axe des x.
----L'apramycine concentration de chaque échantillon (ppb), qui peut être lu à partir de la courbe de calibrage, est multiplié par le correspondant de chaque échantillon multiples de dilution suivie, et la concentration réelle de l'échantillon est obtenu.
Veuillez noter :
Un logiciel spécial a été développé pour toutes les données d'analyse, qui peuvent être fournis sur demande.
Facteur de dilution de l'échantillon :
Tissu animal.....................…45
L'oeuf.....................................................................30
Le miel ................................................................10
11. La sensibilité, de l'exactitude et précision
La sensibilité du test : 0.1ppb
Limite de détection :
Tissu animal.....................…5ppb
L'oeuf......................................................................3ppb
Le miel .................................................................1 ppb
Précision :
Tissu animal.....................….90±20 %
L'oeuf....................................................................100±20 %
Le miel.............................................................110 %±30 %
Précision :
Coefficient de variation de la trousse ELISA est inférieure à 10 %.
12. Avis
12.1 Les valeurs moyennes de l'absorbance valeurs obtenues pour les normes et les échantillons seront réduites si les réactifs et des échantillons n'ont pas été réglementé à température ambiante (20-25 ºC).
12.2 ne permettent pas de micropuits à sec entre les étapes pour éviter d'échec de la reproductibilité et de faire fonctionner l'étape suivante immédiatement après l'appuyez sur les micropuits titulaire.
12.3. Agiter doucement chaque réactif avant utilisation
12.4. Garder votre peau loin de la solution d'arrêt pour qu'il est de 1 M H2SO4 solution.
12.5 Les kits de ne pas utiliser le hors de la date. Ne pas échanger les réactifs de différents lots, pour qu'il va diminuer la sensibilité.
12.6 Garder les trousses ELISA à 2-8ºC,ne pas congeler. Plaques microwell joint reste d'éviter tout droit la lumière du soleil pour l'échantillon standard et le réactif de chromogène incolore sont sensibles à la lumière.
12.7 Solution de substrat doit être abandonnée si elle se transforme les couleurs. Les réactifs peuvent être tourner mal si la valeur d'absorbance (450/630nm) de la norme zéro est inférieure à 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 La coloration des besoins de réaction 15 min après l'ajout de la solution A et la solution B. et vous pouvez prolonger le temps d'incubation si la couleur est trop léger pour être déterminé. Ne jamais dépasser 30min, au contraire, raccourcir le temps d'incubation correctement.
12.9 Le réaction optimale de la température est de 25ºC. Température supérieure ou inférieure conduira à des changements de sensibilité et de l'absorbance de valeurs.
13. Le stockage
Condition d'entreposage : 2-8oC.
Période de stockage : 12 mois.