Miscela master PCR di Gdsbio premiscelata soluzione pronta all'uso con miscela Taq lunga

Descrizione
La miscela Long Taq 2X è una soluzione premiscelata e pronta all'uso contenente DNA polimerasi Long Taq, dNTP, MgCl2  e tampone di reazione a concentrazioni ottimali per un'efficace amplificazione di stampi di DNA mediante PCR. Per preparare la PCR finale, vengono aggiunti solo i primer e il DNA stampo. La miscela di Taq lunga contribuisce alla PCR altamente riproducibile riducendo il rischio di errori di pipettaggio, errori di calcolo e contaminazione. Contribuisce inoltre ad aumentare la sensibilità aggiungendo un potenziatore.
 

La Long taq DNA polimerasi, una combinazione di due DNA polimerasi termostabili, Taq e Pfu, è una formulazione speciale progettata per amplificare frammenti di grandi dimensioni. Questo taq lungo formulato in modo speciale è stato mostrato amplificarsi templati lunghi da genoma di fago λ fino a 20 kb. È inoltre una scelta migliore per amplificare modelli complessi, come ad esempio modelli ricchi di GC. La taq lunga è adatta come sostituzione diretta per la Taq polimerasi ordinaria nella maggior parte delle applicazioni. L'uso di Long taq nelle reazioni PCR produce 3´-da di prodotti PCR che possono essere utilizzati nel clone TA.  

Caratteristiche
Conveniente : quando si prepara la PCR finale vengono aggiunti solo primer e DNA stampo
Elevata efficienza: Risparmio di tempo semplificando il processo  
Riproducibile: Riduzione del rischio di errori di pipettaggio, errori di calcolo e contaminazione

Applicazioni
PCR per stampi lunghi fino a 40 kb
PCR ad alta produttività riproducibile per stampi complessi

Definizione unità
Una unità è definita come la quantità dell'enzima necessaria per catalizzare l'incorporazione di 10 Nm di dNTP in una forma insolubile in acido in 30 minuti a 70°C usando DNA di sperma di ering come substrato.

2×di miscela Taq lunga PCR
20 mm Tris-HCl (pH 8.0), 100 mm KCl, 3 mm MgCl2 , 400 μm dNTP, 0.1 U/μl Long Taq DNA polimerasi, blu bromofenolo

Protocollo PCR di base
1. Aggiungere i seguenti componenti in una provetta sterile per microcentrifuga da 50 μl, appoggiata su ghiaccio:

2. Miscelare il contenuto della provetta e sovrapporre con 50 μl di olio minerale o siliconico.
3. Chiudere le provette e centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto fino al fondo.
Incubare le provette in un termociclatore a 94°C per 3 minuti per denaturare completamente la dima.
5. Eseguire 25-35 cicli di amplificazione PCR come segue:

Incubare per altri 10 minuti a 72°C e mantenere la reazione a 4°C. I campioni possono essere conservati a -20°C fino all'uso.

Note sulle condizioni del ciclo

   La denaturazione iniziale può essere eseguita per un intervallo di 1-5 minuti a 95ºCdepending sul contenuto GC del template.

   Denaturazione per 30 sec a 2 min a 94 95ºCis sufficiente. Se il DNA amplificato ha un contenuto di GC molto elevato, il tempo di denaturazione può essere aumentato fino a 3-4 min

   La temperatura ottimale di ricottura è 5ºC inferiore alla temperatura di fusione del DNA duplex a temperatura di innesco. Se si ottengono prodotti PCR non specifici, l'ottimizzazione della temperatura di ricottura può essere eseguita aumentando la temperatura gradualmente di 1-2ºC.

   Il numero di cicli di PCR dipende dalla quantità di DNA stampo nella miscela di reazione e dalla resa attesa del prodotto di PCR. 25-35 cicli sono solitamente sufficienti per la reazione PCR di maggioranza. Basse quantità di modello iniziale possono richiedere 40 cicli.

   Il tempo della fase finale di estensione può essere esteso per ampliconi che saranno clonati in vettori T/A.

Analizzare i prodotti di amplificazione mediante elettroforesi su gel di agarosio e visualizzarli mediante colorazione con bromuro di etidio. Utilizzare gli standard appropriati per il peso molecolare.

Conservare tutti i componenti a -20°C.