Kit d'immunodosage enzymatique compétitif pour
Analyse quantitative de
Kanamycine
1. Arrière-plan
Les résidus de kanamycine dans la production de
produits biologiques
peuvent entraîner des réactions anormales des êtres humains, ce qui a permis d'établir des LMR strictes.
Ce kit est un produit de test rapide pour la détermination des résidus de tétracycline, sensible, précis et rapide. Il peut réduire considérablement les erreurs de fonctionnement dans le dosage.
2. Principe de test
un conjugué enzymatique
, on utilise un substrat chromogène et le signal est mesuré par
spectrophotomètre
. L'absorption est inversement proportionnelle à la concentration de Kanamycine dans l'échantillon.
3. Applications
Ce kit peut être utilisé dans l'
analyse quantitative et qualitative des
résidus de kanamycine dans
les échantillons biologiques.
4. Réactions croisées
Kanamycine
..........................
…
..
…100 %
Streptomycine .................. …
....
....<1 %
dihydrostreptomycine
..............
…
..........
…<1 %
Néomycine
.................. …
.............
<1 %
5. Matériel requis
5.1 équipements :
Spectrophotomètre pour plaque de microtitration (450 nm/630 nm)
tube à centrifuger en polystyrène : 2 ml, 50 ml
Micropipettes : 20 ml
-200 ml
,
100 ml
-1000 ml
multi-pipette 250 ml
5.2 réactifs :
Eau déminéralisée
6. Composants du kit
-
Plaque de microtitration à 96 puits revêtue d'
un antigène de couplage
-
Solutions standard kanamycine×6 flacons : 1 ml
/
flacon
0 ng/ml,
0,5ng
/ml,
1,5ng
/ml,
4,5ng
/ml,
13,5 ng
/ml,
40,5 ng
/ml
-
Solution étalon de dopage
: 1 ml, 1 μg
/ml
-
Conjugué enzymatique
(
7 ml
)…
..........
…
.....
capuchon rouge
-
Solution d'anticorps
(
10 ml
)............…capuchon vert
-
Solution de substrat A (7 ml).............
…capuchon blanc
-
Solution de substrat B (7 ml)............…
.
…capuchon rouge
-
Solution d'arrêt (7 ml)..................bouchon jaune
-
20
×
solution de lavage concentrée (40 ml)
bouchon
transparent
-
2
×
diluant d'échantillon
(50 ml)
bouchon bleu de l'adaptateur
7. Réactifs préparation :
Solution
1
:
diluant d'échantillon
Diluer le diluant d'échantillon 2×
avec
de l'eau désionisée dans le rapport de volume de 1:
1
, qui sera utilisé pour
la dilution de l'échantillon
. Cette solution peut être stockée à 4ºC
pendant 1 mois.
Solution
2
:
solution de lavage
Diluer la solution de lavage concentrée de 20×avec de l'eau désionisée dans un rapport de volume de 1:19, qui sera utilisé pour laver les plaques. Cette solution peut être stockée à 4ºC
pendant 1 mois.
8
. Préparations d'échantillons
8.1 Avis et précautions à prendre par les utilisateurs avant utilisation :
r. Utilisez des embouts en une seule opération au cours du processus d'expérimentation et changez les embouts lorsque vous absorbez un réactif différent.
b. S'assurer que tous les instruments expérimentaux sont propres, sinon cela aura un effet sur le résultat du dosage.
8.2 préparation des échantillons :
----
diluer l'échantillon à l'aide du
diluant d'échantillon préparé
pour obtenir une concentration finale de
0.5-40.5
ng/ml (kanamycine).
----prendre
20
ml
de la solution préparée pour le dosage.
9. Processus de dosage
9.1 Avis avant le dosage :
9.1.1 Assurez-vous que tous les réactifs et les micro-ondes sont à température ambiante (20 à 25 ºC).
9.1.2 remettre tous les autres réactifs à 2
-
8ºC
immédiatement après utilisation.
9.1.3 le lavage correct des micro-ondes est une étape importante du processus de dosage ; il constitue le facteur essentiel à la reproductibilité de l'analyse ELISA.
9.1.4 Évitez la lumière et couvrez les micro-ondes pendant l'incubation.
9.2 étapes de dosage
9.2.1 sortir tous les réactifs à température ambiante (20 ºC
) pendant plus de 30 min, homogénéiser avant utilisation.
9.2.2 sortez les micro-ondes nécessaires et replacez immédiatement le reste dans le sac à fermeture à glissière à 2-8ºC
.
9.2.3 la solution de lavage doit être portée à température ambiante (20 ºC
)
avant utilisation.
9.2.4
Numéro:
Numéroter chaque position de la micropuits et tous les étalons et échantillons doivent être analysés en double. Noter les positions des étalons et des échantillons.
9.2.5
Ajouter une solution/un échantillon standard
,
un conjugué enzymatique
et un anticorps
: ajouter 20 µl de solution étalon ou d'échantillon préparé dans les puits correspondants. Ajouter 50 µl
de
solution enzymatique conjuguée, 80 µl
de
solution d'anticorps dans chaque puits, mélanger doucement en agitant la plaque manuellement et incuber pendant 40 min à 25 ºC
avec le couvercle.
9.2.6
lavage
: retirez doucement le couvercle et versez le liquide hors des puits et rincez les micro-ondes avec une solution de lavage diluée de 250 µl
(
solution 2
)
à intervalles de 10 s pendant 4-5
fois. Absorber l'eau résiduelle avec du papier absorbant (la bulle d'air résiduelle peut être éliminée avec l'embout inutilisé).
9.2.7
coloration
: ajouter 50µl
de
solution A et 50µl
de
solution B dans chaque puits. Mélanger doucement en agitant la plaque manuellement et incuber 15 min à 25 ºC
avec le couvercle (voir 12.8)
9.2.8
mesurer
: ajouter 50 µl
de
la solution d'arrêt dans chaque puits. Mélanger doucement en agitant la plaque manuellement et mesurer l'absorbance à 450 nm par rapport à un blanc d'air (il est conseillé de mesurer avec la longueur d'onde double de 450/630 nm. Lire le résultat dans les 5 min après l'ajout de la solution d'arrêt. )
(Nous pouvons également mesurer à vue sans solution d'arrêt en l'absence du
lecteur ELISA)
.
10. Résultats
(1)
pourcentage
d'absorbance
Les valeurs moyennes des valeurs d'absorbance obtenues à partir des étalons et des échantillons sont divisées par la valeur d'absorbance du premier étalon (étalon zéro ) et multipliées par 100 %.
=
B --absorbance des étalons ou des échantillons
B0 --absorbance de l'étalon zéro
(0 ng/ml)
(2) courbe standard
---pour tracer une courbe standard : la valeur d'absobance des étalons comme axe y, semi-arithmétique de la concentration des étalons (
ng/ml
) comme axe x.
---la
concentration de kanamycine de chaque échantillon
(
ng/ml
), qui peut être lue à partir de la courbe de calibration, est multipliée par le taux de dilution correspondant de chaque échantillon suivi, et la concentration réelle de l'échantillon est obtenue.
11. Sensibilité, précision et précision
Plage linéaire :
0.5 à 40,5 ng/ml
Précision :
90
±
20
%
Précision :
CV
du kit ELISA tous inférieurs à 10 %.
12. Avis
12.1 les valeurs moyennes des valeurs d'absorbance obtenues pour les étalons et les échantillons seront réduites si les réactifs et les échantillons n'ont pas été réglés à la température ambiante (20-25ºC
).
12.2 ne laissez pas les micro-ondes sécher entre les étapes pour éviter toute répétition infructueuse et passez à l'étape suivante immédiatement après avoir tapoté le support pour micro-ondes.
12.3 mélanger l'homogénat et éluer la plaque de manière adéquate. 12.4 éviter que la solution d'arrêt ne touche la peau pour le H2SO4 2M.
12.5 n'utilisez pas les kits obsolètes. Ne pas échanger les réactifs de différents lots, sinon la sensibilité sera plus élevée.
12.6 Constitution du stockage :
Conserver les kits ELISA à 2-8ºC
sans les congeler. Éviter la lumière directe du soleil pendant toutes les incubations. Il est recommandé de recouvrir les plaques de microtitration.
12.7 les réactifs sont défectueux :
La solution de substrat doit être abandonnée si sa couleur a changé. Les réactifs peuvent être défectueux si la valeur d'absorbance (450/630 nm) de l'étalon zéro est
inférieure à 0.5
(A450nm
<
0.5).
12.8 la réaction de coloration nécessite 20 à 30 min après l'ajout de la solution A et de la solution B, mais vous pouvez prolonger la durée d'incubation de 35 min à 40 min si la couleur est trop claire pour être déterminée. Au contraire, raccourcir correctement le temps d'incubation.
12.9 la meilleure température de réaction est de 25 ºC
, une température trop élevée ou trop basse entraîne des changements de sensibilité et de valeurs d'absorbance
.
13. Conditions de stockage et période de stockage
Conditions de stockage : 2-8ºC
.
Période de stockage :
12
mois.