Kit de dosage immunoenzymatique compétitif
Analyse quantitative de la streptomycine
1. Contexte
La streptomycine est un antibiotique aminosides, qui est largement appliquée dans le traitement des maladies animales. Pour qu'il a de la neurotoxicité et le rein la toxicité, de ses résidus dans les aliments dérivés des animaux est nuisible à l'homme ; il est strictement contrôlé en usage dans l'UE, US et de la Chine. À présent, ELISA est l'approche commune de la supervision et de contrôle des drogues de la streptomycine
Ce kit est un nouveau produit résiduel pour les médicaments détection basée sur la technologie ELISA, qui coûte seulement 45min dans chaque opération et peut considérablement réduire les erreurs de fonctionnement et l'intensité de travail.
2. Principe de test
Ce kit est basé sur ELISA concurrent direct. Le puits Microtiter sont enduites avec couplage anticorps. La streptomycine de résidus dans l'échantillon est en concurrence avec l'enzyme marqueur sur la plaque d'microtiter couché pour l'anticorps. Après l'ajout d'enzyme conjugué, chromegenic substrat est utilisé pour afficher la couleur. L'absorbance de l'échantillon est négativement liée à la streptomycine résidu dans elle, après comparaison avec la courbe standard, multiplié par le facteur de dilution, la streptomycine quantité de résidus dans l'échantillon peut être calculée.
3. Les applications
Ce kit peut être utilisé en analyse quantitative et qualitative de la streptomycine de résidus dans les tissus (porc, poulet, du foie), poissons et de la crevette, le lait (lait cru, lait UHT reconstitué le lait, lait pasteurisé, le lait boissons), le sérum, lait en poudre (poudre de lait entier, lait écrémé en poudre), le miel, de la gelée royale, etc.
4. Les réactions croisées
La streptomycine..................100,0 %
La dihydrostreptomycine...............…....… 106 %
Sulfate de streptomycine.....................67 %
La néomycine.........…....................…<1 %
De gentamycine.....................….....…<1 %
À la kanamycine.........…<1 %
L'amikacine..................…............<1 %
La spectinomycine................<1 %
L'apramycine.............<1 %
5. Matériel requis
5.1 Les équipements
----Plaque Microtiter spectrophotomètre (450nm/630nm)
----L'homogénéisateur
----Mélangeur Vortex
----Centrifuger
----Balance analytique (inductance: 0.01g)
----Pipette graduée, : 10ml
----L'ampoule de pipette en caoutchouc
----Tube à centrifuger en polystyrène : 2ml, 50ml
----Micropipettes : 20 μl-200μl, 100μl-1000μl
250μl-multipipette
5.2 Réactifs
----L'acide trichloroacétique (AR)
----Hydroxyde de sodium (AR)
----L'eau désionisée
6. Composants du kit
Avec la plaque 96 puits Microtiter enduites avec l'antigène
Des solutions standard (6 flacons×1 ml/bouteille)
0ppb,0,05 ppb,0,15 ppb,0,45 ppb,1,35 ppb,4,05 ppb
Solution étalon de fortification : (1 ml/bouteille) 1ppm
Concentré conjugué enzymatique 1ml...….Bouchon rouge
Conjugué enzymatique 10ml de diluant....... capuchon vert
Solution de substrat A 7ml..........…le capuchon blanc
Solution de substrat B 7ml............bouchon rouge
Solution d'arrêt 7ml................…bouchon jaune
La solution de lavage concentrée 20× 40ml
..................Capuchon transparent
2× 50ml de solution concentrée d'extraction
............................…Bouchon bleu
7. Préparation des réactifs
Solution 1 : 1 % de l'acide trichloroacétique
Dissoudre 1,0 g de l'acide trichloroacétique avec 100ml de l'eau désionisée, mélanger complètement.
Solution 2 : 1,5 % Acide trichloroacétique
Dissoudre 1,5 g de l'acide trichloroacétique avec 100ml de l'eau désionisée, mélanger complètement.
Solution 3 : NaOH 0.1MOL/L
Dissoudre 0.4g d'hydroxyde de sodium avec 100ml de l'eau désionisée, mélanger complètement.
Solution 4 : solution d'extraction
Diluer la solution d'extraction 2×concentré avec l'eau désionisée dans le volume ratio de 1:1, qui sera utilisé pour l'extraction de l'échantillon; cette solution peut être entreposée à 4ºC pendant 1 mois.
Solution 5 : solution de lavage
Diluer la solution de lavage 20×concentré avec l'eau désionisée dans le volume ratio de 1:19, qui sera utilisée pour laver les plaques. Cette solution peut être stockée à 4 ºC pendant 1 mois.
8. Préparatifs de l'échantillon
8.1 Avis et précautions avant intervention
(A) Veuillez utiliser one-off de conseils dans le processus d'expérience, et de modifier les conseils d'absorber différents réactif.
(B) Vérifiez que tous les instruments expérimentaux sont propres ; sinon il aura une incidence sur l'essai résultat.
(C) l'échantillon préparé doit être utilisé immédiatement, don de ne pas conserver plus de 4h à température ambiante.
8.2 Tissus porc, poulet, foie)
----Peser 1,0±0,05g de tissu homogénéisé échantillon dans un tube à centrifuger en polystyrène 50ml, puis ajouter 2 ml de 1 % l'acide trichloroacétique(1), Vortex Solution pour le 5min pour mélanger complètement.
---Centrifuger pendant la séparation : 3000G / 5min / température ambiante.
---Prendre 100ml de surnageant, ajouter 30ml de NaOH 0.1MOL/L(solution 3), puis ajouter 870ml de solution d'extraction(4), Vortex Solution pour 30s pour mélanger complètement.
----Prendre 50 ml de la solution préparée pour l'assay.
Facteur de dilution...................30
8.3 Produits Aquatiques
(1)Les crevettes
----Peser 1,0±0,05g de crevettes de l'échantillon homogénéisé dans un tube à centrifuger en polystyrène 50ml, puis ajouter 2 ml de 1 % l'acide trichloroacétique(1), Vortex Solution pour le 5min pour mélanger complètement.
---Centrifuger pendant la séparation : 3000G / 5min / température ambiante.
---Prendre 100ml de surnageant, ajouter 30ml de NaOH 0.1MOL/L(solution 3), puis ajouter 870ml de solution d'extraction(4), Vortex Solution pour 30s pour mélanger complètement.
----Prendre 50 ml de la solution préparée pour l'assay.
(2) Poisson
----Peser 1,0±0,05g de poisson de l'échantillon homogénéisé dans un tube à centrifuger en polystyrène 50ml, puis ajouter 2 ml de 1 % l'acide trichloroacétique(1), Vortex Solution pour le 5min pour mélanger complètement.
---Centrifuger pendant la séparation : 3000G / 5min / température ambiante.
---Prendre 100ml de surnageant, ajouter 900ml de solution d'extraction(4), Vortex Solution pour 30s pour mélanger complètement.
----Prendre 50 ml de la solution préparée pour l'assay.
Facteur de dilution...................30
8.4 lait (lait cru, lait UHT reconstitué le lait, lait pasteurisé, le lait boissons), le sérum
----Ajouter 30 ml de lait ou d'échantillon de sérum dans un tube à centrifuger en polystyrène de 2 ml,
----Ajouter 870ml de solution d'extraction(4), Vortex Solution pour 30s pour mélanger complètement.
----Prendre 50 ml de la solution préparée pour l'assay.
Facteur de dilution...................30
8.5 Le lait en poudre
----Peser 1,0±0,05 g de poudre de lait d'échantillon dans un tube à centrifuger en polystyrène 50ml, puis ajouter 10 ml d'eau désionisée. vortex pour 5 min pour mélanger complètement.
---Prendre 100ml de surnageant, ajouter 900ml de solution d'extraction(4), Vortex Solution pour 30s pour mélanger complètement.
----Prendre 50 ml de la solution préparée pour l'assay.
Facteur de dilution...................100
8.6Honey
----Peser 1,0±0,05 g de miel échantillon dans un tube à centrifuger en polystyrène 50ml, puis ajouter 4 ml de l'eau désionisée, vortex pour 5 min jusqu'à l'échantillon est complètement dissous.
---Prendre 200ml de solution propre, ajouter 600 ml de solution d'extraction(4), Vortex Solution pour 30s pour mélanger complètement.
----Prendre 50 ml de la solution préparée pour l'assay.
Facteur de dilution...................20
8.5 La gelée royale
----Peser 1,0±0,05g de la gelée royale échantillon dans un tube à centrifuger en polystyrène 50ml.
----Ajouter 3 ml de 1,5 % Acide trichloroacétique(solution 2), vortex pour 5min, puis centrifuger à température ambiante (20-25ºC) pendant 5 min, à 3000g;
----Prendre 100ml de la couche surnageante(éviter l'objet flottant), et mélangez avec 110ml de NaOH 0.1MOL/L (solution 3), ajuster le pH à 6 à 8, puis ajouter 790ml de solution d'extraction(4), Vortex Solution pour 1min, mélanger complètement.
----Prendre 50 ml de la solution préparée pour l'assay.
Remarque : Cette méthode peut avoir 2ppb d'effet de fond, qui n'affectera pas la détermination de l'échantillon selon les LMR.
Facteur de dilution...................30
9. Processus de dosage
9.1 Avis avant de dosage
9.1.1 Vérifiez que tous les réactifs et les micropuits sont tous à température ambiante (20-25 ºC).
9.1.2 Retour tous les réactifs de repos à 2-8ºC immédiatement après avoir utilisé.
9.1.3 Laver les micropuits correctement est une étape importante dans le processus de dosage; c'est le facteur essentiel à la reproductibilité de l'ELISA L'analyse.
9.1.4 d'éviter la lumière et de couvrir les micropuits au cours de l'incubation.
9.2 Étapes
9.2.1 Prendre tous les réactifs à la température ambiante (20-25 ºC) pendant plus de 30 min, agiter doucement avant utilisation.
9.2.2 Obtenir les micropuits nécessaires et le reste de retour dans le sac à fermeture par glissière à 2-8ºC immédiatement.
9.2.3 La concentration de la solution de lavage et de l'extraction de concentré de solution devrait être réchauffés avant de les utiliser ;
9.2.4 Nombre : nombre chaque micropuits position et toutes les normes et les échantillons doivent être exécutées en double. Enregistrer les normes et des échantillons des postes.
9.2.5 Ajouter la solution standard/échantillon : ajouter 50 µl de solution étalon ou de l'échantillon préparé à puits correspondant.
9.2.6 Diluer le concentré enzyme conjugué : Mélanger le concentré conjugué enzymatique et conjugué enzymatique diluant dans le volume ratio de 1:10(p. ex. 0,5 ml de concentré conjugué enzymatique + 5 ml de diluant conjugué enzymatique ), mélangez complètement, (ce mélange ne peut pas être conservée, utiliser immédiatement).
9.2.7 Ajouter l'enzyme conjugué dilué (9.2.6) : Ajouter 50 µl de l'enzyme conjugué dilué à chaque puits, agiter la plaque de mélanger manuellement puis incuber pendant 30 min à 25 ºC avec couvercle.
9.2.8 Laver : déposer le couvercle doucement et verser le liquide des puits et rincez les micropuits avec 250 µl de solution de lavage dilué (solution 5) à l'intervalle de 10s pour 4 à 5 fois. Absorber l'eau résiduelle avec du papier absorbant (le reste de l'air bulle peut être éliminé avec pointe inutilisé).
9.2.9 La Coloration : ajouter 50µl de solution A et 50µl de solution B à chaque puits. Mélanger doucement par agitation de la plaque manuellement et incuber pendant 15 min à 25ºC avec couvercle (voir 12.8)
9.2.10 Mesure : ajouter 50 µl de la solution d'arrêt à chaque puits. Mélanger doucement par agitation de la plaque manuellement et mesurer l'absorbance à 450Nm (il est recommandé de mesurer avec le double longueur d'onde de 450/630nm. Lire le résultat dans un délai de 5 min après l'addition de solution d'arrêt).
10. Les résultats
10.1 Pourcentage l'absorbance
Les valeurs moyennes de l'absorbance valeurs obtenues pour les normes et les échantillons sont divisés par la valeur d'absorbance de la première norme standard (zéro) et multiplié par 100 %. Le standard zéro est donc égale à 100 % et l'absorbance valeurs sont cités dans les pourcentages.
B --l'absorbance de la norme (ou l'échantillon)
B0 --l'absorbance de la norme zéro
10.2 Courbe standard
----Pour dessiner une courbe standard : prendre la valeur d'absorbance de normes comme l'axe des y, semi logarithmique de la concentration de la solution de normes de la streptomycine (ppb) comme axe des x.
----La streptomycine concentration de chaque échantillon (ppb), qui peut être lu à partir de la courbe de calibrage, est multiplié par le facteur de dilution correspondante de chaque échantillon suivie, et la concentration réelle de l'échantillon est obtenu.
Veuillez noter :
Un logiciel spécial a été développé pour toutes les données d'analyse, qui peuvent être fournis sur demande.
11. La sensibilité, de l'exactitude et précision
La sensibilité du test : 0,05 ppb
Limite de détection
Les tissus.....................….…...…1.5ppb
Les poissons et crevettes...............….…...…1.5ppb
Le lait,......................…1.5Ppb sérique
La poudre de lait ........................….......5ppb miel.....................….….......1 ppb
La gelée royale................…1.5ppb
La précision
Tissu/poisson et de crevettes/sérum /miel / La gelée royale.............................................................90±15%
Lait/lait en poudre .....................................................…100±30 %
La précision
Coefficient de variation de la trousse ELISA est inférieure à 10 %.
12. Avis
12.1 Les valeurs moyennes de l'absorbance valeurs obtenues pour les normes et les échantillons seront réduites si les réactifs et des échantillons n'ont pas été réglementé à température ambiante (20-25 ºC).
12.2 ne permettent pas de micropuits à sec entre les étapes pour éviter d'échec de la reproductibilité et de faire fonctionner l'étape suivante immédiatement après l'appuyez sur les micropuits titulaire.
12.3. Agiter doucement chaque réactif avant utilisation.
12.4. Garder votre peau loin de la solution d'arrêt pour qu'il est l'H2SO4 0,5 M solution.
12.5 Les kits de ne pas utiliser le hors de la date. Ne pas échanger les réactifs de différents lots, pour qu'il va diminuer la sensibilité.
12.6 Garder les trousses ELISA à 2-8ºC,ne pas congeler. Plaques microwell joint reste d'éviter tout droit la lumière du soleil pour l'échantillon standard et le réactif de chromogène incolore sont sensibles à la lumière.
12.7 Solution de substrat doit être abandonnée si elle se transforme les couleurs.Les réactifs peuvent être tourner mal si la valeur d'absorbance (450/630nm) de la norme zéro est inférieure à 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 La coloration des besoins de réaction 15 min après l'ajout de la solution A et la solution B. et vous pouvez prolonger le temps d'incubation à 20min si la couleur est trop léger pour être déterminé. Ne jamais dépasser 25min, au contraire, raccourcir le temps d'incubation correctement.
12.9 Le réaction optimale de la température est de 25ºC. Température supérieure ou inférieure conduira à des changements de sensibilité et de l'absorbance de valeurs.
13. Le stockage
Condition d'entreposage : 2-8ºC.
Période de stockage : 12 mois.